Главная


Автошкола запорожье курсы водителей в запорожье.

Расщепление папаином

Материалы и оборудование

Для работы необходимы IgG кролика, меркурипапаин, 0,01 М цистеин и 0,002 М ЭДТА-натриевая соль в 0,1 М натрий-фосфатном буфере с рН 7,0, 0,1 М фосфатный буфер с рН 6,5, 0,01 М ацетатный буфер с рН 5,5, 0,9 М ацетатный буфер с рН 5,5, КМ-целлюлоза, хроматографическая колонка 2,4х35 см.

Методика

Растворяют 150 мг IgG и 1,5 мг меркурипапаина в 10 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,0, содержащего ЭДТА и цистеин. Инкубируют смесь 16 ч при 37 °С и против дистиллированной воды, диализуют при энергичном перемешивании в течение 48 ч при 4°С. Продукты расщепления подвергают диализу против 0,01 М ацетатного буфера с рН 5,5 и хроматографируют на КМ-целлюлозе. Элюирование проводят градиентом фосфатного буфера 0,01—0,9 М с рН 5,5 (см. рисунок).

Хроматография фрагментов IgG кролика, полученных при обработке папанном, на КМ-деллюлозе

Хроматография фрагментов IgG кролика, полученных при обработке папанном, на КМ-деллюлозе

Градиент ацетатного буфера: 0,01 М, рН 5,5—0,9 М. рН 5,5. По ординате — оптическая плотность при длине волны 280 им

Хроматографию выполняют при комнатной температуре для предотвращения кристаллизации Fc-фрагмента. Фракции I и II представляют собой Fab-фрагменты различных молекул иммуноглобулинов, фракция III содержит Fc-фрагменты.

Fc-фрагменты характеризуются выраженной склонностью к кристаллизации при рН, близком к нейтральному (5,0—7,5), их можно перекристаллизовать, диализуя растворенную в 0,02 М уксусной кислоте фракцию III против 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,5 при 4°С.

Обсуждение

Для расщепления IgG на Fab- и Fc-фрагменты используют ртутные производные папаина или его кристаллическую форму. Реакция прекращается либо вследствие окисления кислородом воздуха, либо при добавлении N-этилмалеимида, йодацетамида или йодуксусной кислоты. IgG различных биологических видов неодинаково расщепляются папаином. Вышеприведенные условия разделения Fab- и Fc-фрагментов на КМ-целлюлозе не позволяют провести фракционирование человека, хотя в принципе этот ионообменник использовать можно. Выход Fc-фрагмента после 1,5-часового гидролиза в присутствии 0,01 М цистеина и 0,002 М ЭДТА при рН 7,0 достаточно выражен.

После гидролиза проводят диализ против 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,6, затем разделяют фрагменты на КМ-целлюлозе. В первом пике выходят Fc-фрагменты, во втором — Fab. Оба пика содержат также некоторое количество IgG. После концентрирования из первого пика выкристаллизовывается Fc-фрагмент в 0,2 М фосфатном буфере с рН 7,6 против 0,002 М фосфатного буфера при 4°С. Увеличение длительности протеолиза до 16 ч приводит к увеличению выхода низкомолекулярных продуктов. Папаиновые фрагменты IgG человека могут быть разделены также на ДЭАЭ-целлюлозе в градиенте фосфатного буфера с рН 7,7 0,007—0,7 М. При ионной силе 0,01 в трис-HCl-буфере с рН 8,0 Fab-фрагменты не адсорбируется на ДЭАЭ-целлюлозе, а Fc-фрагменты связываются. Последние затем элюируют 0,3 М NaCl в том же буфере.

Цистеин не только активирует папаин, но также вызывает конформационные изменения субстрата вследствие восстановительного расщепления дисульфитных связей между γ-цепями. При протеолизе IgG кролика папаином было обнаружено, что восстановление дисульфидных связей между γ-цепями Fc-фрагмента зависит от концентрации цистеина. Концентрация 0,001 М оказывается неэффективной, полное восстановление наблюдается при концентрации 0,02 или 0,05 М. При длительном (свыше 10 ч) гидролизе папаин выщепляет тот участок Fc-фрагмента, где расположена дисульфидная связь. При рН 4,5—5,0 наблюдается особенно интенсивное разрушение Fc-фрагмента. Из 4 субклассов IgG человека наиболее чувствителен к папаину IgG3, за ним следуют IgG 1 и IgG 2, наименее чувствителен JgG 4.

Папаин разрушает Fc-фрагменты чувствительных субклассов. Гетерогенность Fc-фрагмента выявляется при электрофорезе в крахмальном геле, например, Fc-фрагменты папаинчувствительных субклассов IgG отличаются от Fc-фрагментов миеломных IgG. В присутствии цистеина IgG человека расщепляется, образуя в небольших количествах Fc-фрагмент. Fc-фрагмент состоит из нековалентно связанных димеров и при электрофорезе мигрирует в сторону анода быстрее, чем Fc-фрагмент.

Расщепление IgG папаином в присутствии восстанавливающих агентов приводит к отщеплению небольших пептидов от Fc-фрагмента. Fab-фрагмент подвергается восстановительному расщеплению 0,2 М меркаптоэтанолом. При этом образуются легкая цепь и Fd-фрагмент, который выделяется гель-фильтрацией на сефадексе G-75 в присутствии 1 М пропионовой кислоты. Fd-фрагмент IgG кролика в этих условиях элюируется в форме димера. Однако в 8 М мочевине с рН 3,5 его относительная молекулярная масса составляет 21 600, а Fab-фрагмента в тех же условиях —40 700. Fd-фрагмент IgG человека в 1 М пропионовой кислоте с 6 М мочевиной отделяется на сефадексе G-100 от легких цепей. Но и в этих условиях обнаруживаются димеры Fd-фрагмента.

Трипсиновые фрагменты IgG человека разделяют при комнатной температуре методами ионообменной хроматографии (см. разделение папаиновых фрагментов). Дальнейшую очистку проводят на сефадексе G-75. IgG инкубируют в 0,1 М трис-HCl-буфере с рН 8,0, содержащем 0,02 М СаС12; соотношение фермент/субстрат составляет 1:50. Помимо tFab- и tFc-, образуются Fab- и Fc-фрагменты. Протеолиз останавливают через: 16 ч добавлением ингибитора трипсина. tFab- и tFc- соответствуют Fab- и Fc-фрагментам, но отличаются от них по электрофоретической подвижности. Относительная молекулярная масса (отн. мол. масса) фрагментов составляет 52 000. tFab´- и tFc´-представляют собой продукты расщепления tFab- и tFc-фрагментов, их отн. мол. масса составляет 28 000. IgG разных субклассов неодинаково чувствительны к гидролизу трипсином, известны также видовые различия, например, IgG кролика устойчив к действию трипсина. Протеолиз IgM папаином (см. рисунок) приводит к образованию Fabμ.

Протеолитическое и восстановительное расщепление IgM

Протеолитическое и восстановительное расщепление IgM

После восстановления 0,1 М меркаптоэтанолом с последующим алкилированием этот фрагмент при помощи гель-фильтрации в 1 М пропионовой кислоте можно разделить на Fdμ и легкие цепи. Fcμ быстро распадается на мелкие фрагменты, его можно выделить только после непродолжительного (45 мин) гидролиза. В отсутствие цистеина можно получить (Fc)2μ, папаиновым протеолизом. Обработкой IgM человека трипсином при 37 °С можно получить Fabμ и ,Р(аb)2μ-фрагменты (см. рисунок).

Рис. 131. Фрагменты IgM [Fabμ; F(ab´)2μ; (Fc)5μ,]. ∞ — углеводная часть

Рис. 131. Фрагменты IgM [Fabμ; F(ab´)2μ; (Fc)5μ,]. ∞ — углеводная часть

Обработка трипсином, при 56°С приводит к расщеплению IgM до Fabμ- и (Fc)5μ,-фрагментов. Максимальный выход (Fc)5μ наблюдается через 30 мин. Реакцию останавливают добавлением ингибитора трипсина; фрагменты разделяют на сефадексе G-200. Первый пик содержит (Fc)5μ, второй большой пик —Fabμ. (Fc)5μ и Fabμ, можно доочистить на ДЭАЭ-целлюлозе. Мономерный Fcp, получают мягким восстановлением  (Fc)5μ 0,004 М дитиотреитолом с последующим алкилированием 0,01 М йодацетамидом. Fcμ, отделяют от соответствующего пентамера гель-фильтрацией на сефадексе G-200.